Projekty ÚCL

Krev

V letech 1999 - 2002 byl na OHBKT zpracován výzkumný koncepční úkol s kódovým označením "Krev" a názvem "Zabezpečení armády krví a krevními deriváty za bojové pohotovosti státu".
Řešitelem byl pplk. MUDr. Miloš Bohoněk a zadavatelem Národní úřad pro vyzbrojování MO ČR, kdy úkol byl v řešen jako projekt obranného výzkumu.
Předmět a výsledky popisuje dále uvedená závěrečná zpráva.

1. Souhrn
Zabezpečení armády krví je řešeno systémem distribuce z vojenského transfúzního centra, které přímo zásobuje krví ROLE 3 a 4 a zahraniční mise. ROLE 2 je v případě potřeby zásobena z ROLE 3 přípravky od univerzálních dárců, v ROLE 1 se s podáním krve nepočítá. Vojenské transfúzní centrum je kapacitní výrobní základna transfúzních přípravků, s vysoce sofistikovanými a automatizovanými postupy, které zajišťují dostatečný standard a kvalitu přípravků. Odběry dárců krve zajišťují mobilní odběrové týmy, schopné odebrat dárce i v polních podmínkách. Trvalou rezervní zásobu erytrocytů pro náhlé situace představuje banka hluboko mražených erytrocytů v teritoriu. Jejich skladování a použití v poli, stejně jako použití umělých kyslíkových nosičů, bude předmětem dalšího výzkumu.

2. Vlastní zpráva
2.1 Úvod

Členství v NATO vyžaduje mj. splnění cíle TFG č. 4031a od 1. 1. 2001, který je součástí "Souboru cílů výstavby sil NATO", pod číslem EG 4231 jako "Zdravotnické zabezpečení, doktrína a postupy" (Medical support capabilities doctrine and procedures): jasně vymezeny povinnosti v zásobování krví a jejími složkami. Cíl má nevyšší prioritu (I.) a ČR byl projednán a přijat na Join Screening Comitee velitelství NATO v Bruselu dne 12. 4. 2000.
Součástí tohoto cíle, který je původním cílem interoperability č. 2. 4. 3 G, je i vybudování funkční vojenské transfúzní služby, která zabezpečí zásobování krví AČR, a to za předpokladu vzniku všech možných situací. Vypracování metodik, systému a stálý výcvik v oboru je možný jen na specializovaném pracovišti, které je plně v provozu i v mírových podmínkách, jakým je OHBKT ÚVN.

2.2 Cíle projektu

Hlavním cílem bylo na základě přesné specifikace moderního léčebně odsunového systému vypracovat zásady zásobování krví AČR podle zadání ROLE 1- 4.Jednou z podmínek je vypracování systému získávání dostatečného množství krve po potřeby AČR ,a to za války i v dalších krizových situacích státu, jejího zpracování, uchovávání, transportu a použití v polních podmínkách.

2.3 Současný stav ve světě

V zemích NATO existují v současné době 2 organizační přístupy (modely) řešení vojenské transfúzní služby a vojenského zdravotnictví obecně:
Model 1.: Armáda má vlastní plnohodnotné a soběstačné vojenské zdravotnictví, včetně vojenských nemocnic, disponuje vlastní výkonnou transfúzní službu s výrobní a výzkumnou základnou. Vojenská transfúzní služba zásobuje transfúzními přípravky vojenské nemocnice a polní zdravotnická zařízení, zejména v případě zahraničních misí, a je zapojena do systému národní transfúzní služby, kde oboustranně spolupracuje s civilním sektorem, tj. jako dodavatel i odběratel transfúzních přípravků a laboratorních služeb.
Model 2.: Armáda nedisponuje výkonnými územními zdravotnickými zařízeními ani vlastní výrobou transfúzních přípravků. Vojenská transfúzní služba je organizována pouze v "polní podobě" jako krevní sklady polních nemocnic včetně logistického systému zásobování krví. V teritoriu pak vojenská transfúzní služba představuje pouze metodické vedení a distribuční sklad, který provádí zásobování polních zařízení a zahraničních misí, a zpravidla zajišťuje centrální vyšetření krevních skupin příslušníků armády a vede databázi skupin v systému AB0 Rh. Podmínkou tohoto organizačního uspořádání je smluvní řešení dodávek transfúzních přípravků z civilních zařízení transfúzní služby se stanovenými prioritami.

2.4 Metodika řešení

V daném případě se jednalo o navržení koncepčního řešení na základě vlastních odborných zkušeností, doplněných o zahraniční praxi, kdy nutným předpokladem bylo sledování vývoje konceptu léčebně odsunového systému AČR s novými definicemi ROLE 1 - 4 a jeho aktuální reflexe.
V souladu s tímto projektem byl v roce 1999 dokončen vývoj a výroba speciálních mobilních prostředků vojenské transfúzní služby (ATOS a CHPK) a začátkem roku 2002 biochemicko-hematologické laboratoře polní nemocnice (BHL-PN), které byly sice předmětem zvláštního zadání, na kterých se ale autor projektu podílel jako odborný konzultant, oponent a předseda komise vojskových zkoušek.
Nutnou podmínkou pak byl vývoj a realizace některých technických řešení, které umožní praktické ověření navrhovaných variant konceptu a jeho následné definitivní provedení. Podstatným výzkumným úkolem tohoto projektu bylo proto vytvoření informačních technologií, které umožní kapacitní výrobu transfúzních přípravků při zachování maximální bezpečnosti podle posledních trendů zásad správné výrobní praxe v transfúzní službě.

2.5 Dosažené výsledky
2.5.1 Byla definována vojenská transfuzní služba v AČR a její úloha:

Vojenská transfuzní služba je vysoce specializovaná složka vojenského zdravotnictví, která:

a/ v době míru:

• zásobuje transfuzními přípravky a krevními deriváty vybraná vojenská (event. civilní) zdravotnická zařízení
• provádí výcvik a školení ve své odborné působnosti
• skladuje a obměňuje speciální zdravotnický materiál
• podílí se na správě hmotných rezerv krevních derivátů a transfúzních přípravků
• provádí centralizované vyšetření krevních skupin příslušníků ozbrojených sil, vede jednotnou databázi

b/ v době krizové situace na území státu:

• zabezpečuje zásobování krví rozvinuté výkonné vojenské zdravotnické jednotky (polní a stacionární vojenské nemocnice)
• ve spolupráci s civilní transfúzní službou se podílí na řešení problematiky krizové krevní politiky státu

c/ zásobuje krví zahraniční mise AČR, případně spojeneckých vojsk

2.5.2 Byla definováno zásobování krví v AČR v podmínkách definic ROLE 1 - 4:

• ROLE 1: Provádí se zde pouze zástava krvácení bez krevní náhrady (fibrinové bandáže, event. náhradní roztoky), na tomto stupni není laboratoř
• ROLE 2: Provádí se zde stabilizační chirurgie, náhrada krevních ztrát pomocí volumexpanderů, výjimečně erytrocytovým koncentrátem skupiny O neg, který je dopravován z ROLE 3 a skladován v pasivních nebo aktivních termoboxech. Z laboratorních metod je k dispozici pouze základní krevní obraz a biochemie na bázi suché chemie. Křížové pokusy se neprovádí.
• ROLE 3: Na tomto stupni se provádí život a končetiny zachraňující chirurgie a intenzivistická péče. ROLE 3 je vybavena polním laboratorním modulem, jehož součástí je krevní sklad a možnosti imunohematologických vyšetření, kde jsou jednoznačně doporučeny kompaktní metodiky na základě sloupcové gelové aglutinace. Zásobování transfúzními přípravky je přímo z vojenského transfúzního centra.
• ROLE 4: Jedná se o územní stacionární nemocnice, transfúzními přípravky zásobované přímo z vojenského transfúzního centra.

Následující schémata znázorňují výše popsanou definici ROLE 1 - 4 a příslušné úkoly při zásobování krví:

ROLE 1 - 4

Pozn.: Standardní hemoterapie, prováděná substitucí transfúzními přípravky (tj. erytrocyty a plazmou), spolu s prováděním křížových pokusů, se předpokládá až od ROLE 3. Na ROLI 1 přichází v úvahu pouze z vitální indikace podané erytrocyty skupiny 0 neg, dovezené a event. skladované v přepravním aktivním, v nouzi pasivním, transportním boxu z ROLE 3.

ROLE 1 - 4

Pozn.:
Definice krevní banky polní nemocnice (ROLE 3):

Je integrální součástí polní laboratoře, která je podle velikosti v jednom kontejneru ( typ např. pro 6. PN) nebo je ve zvláštním kontejneru (typ vyvíjený např. pro 7. Zdr. Pr.).

Vybavení:

• chladnice s registrací teplot
• mrazící box s registrací teplot
• pracoviště pro imunohematologická vyšetření (metodika gelové aglutinace)
• výkonná klimatizace

2. 5. 3 Byla vyvinuta a realizována v ČR ojedinělá computerizace procesu výroby transfúzních přípravků:

Pro zajištění kapacitního a bezproblémového zásobování transfúzními přípravky se řešitel projektového úkolu mj. soustředil na automatizaci procesu výroby transfúzních přípravků ve vojenském transfúzním centru. Účelem bylo dosažení maximální efektivnosti a standardizace výroby transfúzních přípravků při minimalizaci manuální pracovní síly a vlivu lidského faktoru. Význam tohoto řešení je nejen ve zlepšování podmínek správné výrobní praxe v mírových podmínkách, ale zejména v možnosti pružného zareagování na potřebu zvýšené výroby při řešení krizových situací v zásobování krví při zajištění vysoce kvalitní výroby se zabudovanými automatizovanými prvky kontroly. Moderní jakostní výroba nejvyšších standardů též umožní bezproblémové zásobování krví spojeneckých vojsk NATO.
Těžištěm vývoje byly zejména softwarové prostředky umožňující připojení technických zařízení v procesu výroby do informačního systému řídícího transfúzní výrobu, s integrovanou pozitivní identifikací operátora, daného zařízení a evidenčního čísla odběru. Data z jednotlivých výrobních operací jsou pak obsažena v tisku protokolů.
Použité informační technologie jsou od firmy AMIS a. s. Brno, v současné době již začleněné do ICZ a.s. Praha, která je dodavatelem většiny informačních systémů do ÚVN Praha. Informační systém je realizován v prostředí UNIX a je konstruován modulovým způsobem, kdy v tomto případě jsou využívány modul "transfúzní stanice" (TS) a modul "hematologická laboratoř" (HEM).
Zařízení na diagnostiku, která provádějí vyhodnocování výsledků povinných laboratorních vyšetření (krevní skupina AB0 Rh, protilátky proti erytrocytům, HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1/2 a TPHA), předávají naměřená data prostřednictvím HEM do TS již v interpretované podobě naměřených hodnot. Podmínkou takového řešení je pozitivní indentifikace vzorku (evidenční číslo odběru), které je zajištěno čárovým kódem na primární zkumavce a jeho načtením v rozplňovacím zařízení v rámci diagnostického procesu. V modulu TS jsou výsledky ve výsledné podobě znázorněny v protokolech o vyšetření.
Výrobní zařízení jsou prostřednictvím terminálových serverů napojeny systémově přímo do modulu HEM. Přenos dat zajišťuje obsluha po vlastní pozitivní identifikaci čárovým kódem na osobní vizitce pracovníka z PC napojeného na informační systém.

Napojena jsou tato výrobní zařízení:

• odběrové váhy (typ Baxter-Optimix): do vnitřní paměti vah jsou zaznamenávány jednotlivé odběry (kapacita až 50 odběrů), včetně operátora (čtečka čárového kódu připojená na váhu); po ukončení odběrů jsou z vah na transfuzní stanici postupně převedena data do systému, kdy se zaznamenává: operátor - číslo odběru - číslo váhy - hmotnost odebrané krve - délka trvání odběru

• odstředivky na zpracování odebrané krve (typ Hereaus 6000i): před vložením do odstředivky jsou "načteny" jednotlivé vaky; systém zaznamenává: operátor - číslo odstředivky - evidenční čísla odběrů - zvolený program a jeho parametry - čas zahájení a ukončení centrifugace

• lisy na extrakci krevních složek: typ v době řešení (Baxter-Optipres II) neumožňoval sběr dat, provedena byla výměna za nový typ Baxter-Optipres III - Optilink, který kromě plně automatického provozu zajišťuje též sběr potřebných dat ze zpracování krve

• šokový zmrazovač plazmy (typ Anselma NZK 96/80): před vložením do zmrazovače jsou "načteny" jednotlivé vaky s plazmou a po náplni je na záznamovém zařízení spuštěn čas; systém zaznamenává: operátor - evidenční čísla odběrů - čas zahájení zmražování a vstupní teplota - čas ukončení zmražování

• separátory krevních složek (typ Haemonetics MCS+): po provedení každé separace je proveden převod dat do informačního systému, když předem je prostřednictvím čtečky čárového kódu do zařízení zadán operátor a evidenční číslo odběru; systém zaznamenává: operátor -  evidenční číslo odběru - protokol a typ odběru - množství odebrané složky krve - čas zahájení a ukončení odběru.

2.5.4 Byl definován a v praxi ověřen výjezdový odběrový tým a funkce a rutinní vyžívaní prostředků ATOS a CHPK:

Složení jednoho optimalizovaného odběrového týmu je: lékař - 3 odběrové sestry - administrativa - řidič / pomocný laborant. Odběrový tým operuje zpravidla se zajištěním pomoci nekvalifikovaného zdravotnického i nezdravotnického personálu po zaškolení na místě (vstupní administrativa dárců krve, měření hemoglobinu, tělesné teploty, krevního tlaku a pulsu, pořadatelská činnost, výdej občerstvení apod.) a rozvinuje se ve vhodných prostorách stacionárních budov. Na 6ti odběrových křeslech má kapacitu až 50 odběrů plné krve za hodinu.
K přepravě osob a materiálu plně vyhovuje prostředek ATOS, pouze v případě plánovaného většího množství dárců krve vyjíždí společně též CHPK, který umožňuje posílit odběrový tým o další 2 osoby (řidič / pomocný laborant + zdravotní sestra nebo kvalifikovaný NZP).
Pokud se provádí odběry dárců krve v rozvinutém prostředku ATOS, je průchodnost omezena na max. 12 osob za hodinu. Průchodnost je možné zvýšit za pomoci např. POP (další 2 odběrová místa) nebo dalšího stanu. Čas plného rozvinutí ATOS je s vycvičeným týmem do 45 min., čas plného svinutí do 20ti min.

2.5.5 Byla definována potřeba banky hluboce zmražených erytrocytů.

Koncepce vojenské transfúzní služby počítá s bankou hluboce zmražených erytrocytů, případně i trombocytů ve Vojenském transfúzním centru. V kryobance bude uschována jednak pohotovostní zásoba erytrocytů s převahou krevní skupiny 0, dále vzácné erytrocyty pro klinickou potřebu v míru i za války a erytrocytární přípravky pro speciální použití, např. imunizační dávky pro anti-D imunizaci dárců hyperimunní plazmy. Další využití kryobanky je v přípravě a skladování autologních erytrocytů. Kryokonzervované erytrocyty též nabízejí možnost snadno mobilizovatelné zásoby krve při nebezpečí z prodlení pro náhlé krizové nebo katastrofické situace.

2.6 Diskuse
Navržený systém zásobování krví a transfúzními přípravky je založen na zcela jiném základě, než dřívější koncepty ČSLA, operující s pojízdnou transfúzní stanicí, vybavenou na provádění odběrů a zpracování krve v poli. Moderní koncept transfúzní služby je založen na kapacitní výrobní základně a kapacitním, flexibilním a bezpečném systému přepravy krve. Jeho součástí jsou též mobilní odběrové týmy, které jsou schopny odebrat krev i v polních podmínkách a místech soustředění vojsk a dopravit ji ke zpracování do výrobní základny. V průběhu řešení tohoto projektu, ale nezávisle na něm, byly vyvinuty a zavedeny do používání v AČR též speciální prostředky ATOS (automobil odběrový transfúzní) a CHPK (chladící přepravník krve), které po technické stránce řeší dopravu krve a odběrového týmu. Model zásobování všech zařízení v ROLE 3 a 4 z jednoho transfúzního centra je běžný ve většině členských zemí NATO, bez ohledu na místo plnění úkolů na teritoriu nebo v zahraniční misi. Rozdílnost přístupu je pouze ve výrobě transfúzních přípravků, kdy některé členské státy NATO (např. Velká Británie, Holandsko, Belgie) zredukovaly transfúzní centrum v teritoriu pouze na distribuční krevní sklad, bez vlastní výroby, kterou zabezpečují na smluvním základě civilní zařízení. Tyto země ale též ukončily činnost územních vojenských nemocnic. V našem řešení jsme zvolili model podobný jako např. v USA nebo SRN, kde zůstává, resp. naopak posiluje výrobní základna transfúzních přípravků (stejně jako se nepočítá se zrušením vojenských nemocnic). Důvodem je jednak důraz na kvalitu transfúzních přípravků, ale i roztříštěnost sítě národní transfúzní služby v ČR, která nemůže zabezpečit potřeby vojenského zdravotnictví. K doplnění navrhovaného konceptu ještě zbývá vybudování banky hlubokomražených erytrocytů, která umožní vytvoření strategických zásob krve. Tento úkol by měl být předmětem dalšího výzkumného projektu, který by měl vyřešit 2 otázky: 1/ vypracování a standardizace metodiky získávání, mražení a skladování erytrocytů, případně též trombocytů, 2/ definování způsobu jejich použití spolu s otázkou použití v poli. Ke splnění normy STANAG 2939 je potřeba mít zajištěn mj. systém ověřeného stanovení krevní skupiny AB0 Rh u příslušníků ozbrojených sil s jednotnou databází. Krevní skupina je pak uvedena v osobním průkazu a na identifikační známce. Toto opatření sice nijak neupravuje povinnost laboratorního stanovení krevní skupiny před podáním krevní transfuze, v případě vypjaté situace např. v polních podmínkách spoluověřuje správnost provedeného vyšetření a navíc může sloužit jako jeden z identifikačních prvků raněného. Aby byla zajištěna dostatečná věrohodnost provedeného vyšetření, je nutná jeho centralizace na jedno autorizované pracoviště z celé republiky - tj. vojenské transfúzní centrum - a vyšetření je nutné zopakovat nebo provést ze 2 nabraných vzorků. Současně centrálně vedená databáze krevních skupin AB0 Rh, kterou je možné poskytovat do polních nemocnic nebo jiných vojenských nemocnic, přispívá k bezpečnosti provádění transfuzí u příslušníků ozbrojených sil. Realizace navrhovaného konceptu je v plné míře možná až po vybudování nového transfúzního centra na základech stávajícího Oddělení hematologie, biochemie a krevní transfuze Ústřední vojenské nemocnice Praha a po pokroku v profesionalizaci armády, kdy zejména odběrové týmy a distribuce transfúzních přípravků musí být zajišťována vojenskými odborníky. Další podmínkou je vypracování vládního usnesení na zásobování krví a transfúzními přípravky za krizové situace státu a dohody o spolupráci mezi resorty ministerstva obrany a ministerstva zdravotnictví, protože v případě krizové situace většího rozsahu není otázky zásobení krví a jejích dodávek v ČR řešena a výrobní kapacita samotného vojenského transfúzního centra nemusí pokrýt ani potřeby AČR. Perspektivní metodou, která by mohla umožnit zcela nové přístupy v řešení krevních ztrát v poli, je použití umělých kyslíkových nosičů, ať již ze skupiny roztoků hemoglobinu nebo ze skupiny perflourokarbonů. V tomto směru bude potřeba vyvinout úsilí směrem k zahájení dalšího výzkumného úkolu.

2.7 Využitelnost dosažených výsledků

Dosažené výsledky se již nyní využívají v rutinním provozu Oddělení hematologie, biochemie a krevní transfuze ÚVN Praha a při zásobování zahraničních misí AČR. Jedná se o činnost odběrového týmu, provoz ATOS a computerizaci procesu výroby transfúzních přípravků.

2.8 Návrh konkrétních opatření

Výčet návrhů opatření uvedených v diskusi:

• Vybudování banky zmražených erytrocytů s vyvinutím optimální metodiky, zajištění systému financování.
• Profesionalizace vojenské transfúzní služby, zejména odběrových týmů, obsluhy ATOS a CHPK a částečně laboratoří.
• Vhodným nařízením zajistit jednotný odběr a centralizované vyšetření krevní skupiny AB0 Rh příslušníků AČR. Součástí opatření musí být zajištění svozu odebraných vzorků, kdy je možné využít i běžně dostupné civilní cesty (např. České dráhy, expresní zásilkové služby apod.), s podmínkou doručení do 5ti dnů od odběru.
• Realizace výstavby kapacitního vojenského transfúzního centra - řešeno v rámci rekonstrukce ÚVN Praha, pavilon B3 střed.
• Vypracování konceptu krizové krevní politiky státu, založené na meziresortní dohodě ministerstva obrany a ministerstva zdravotnictví, společné definování a vybudování hmotných rezerv v oblasti krevních derivátů a plazmy, včetně systému jejich obměny, vymezení zodpovědnosti jednotlivých resortů a jejích složek.
• Je nutné zavést a standardizovat metodiku hlubokého mražení erytrocytů a systém jejich použití, tuto otázku řešit dalším projektem obranného výzkumu, stejně jako možnosti použití umělých kyslíkových nosičů.

Výzkumný projekt - Kryokonzervace erytrocytů - vybudování banky zmražené krve: "Strategická krevní banka"

1. Úvod

Zásobování krví a transfúzními přípravky a náhrada krve je stálým strategickým a logistickým problémem zdravotnické služby armád celého světa, který vyplývá z podstaty krve jako léčiva, tj. biologického přípravku, který má omezenou dobu použitelnosti, specifické a omezující podmínky přepravy, skladování a aplikace pacientům. Ze shodného důvodu je problematická tzv. krizová krevní politika státu, kdy při zachování obvyklých a běžně používaných postupů je obtížné zajistit dostatečné zásoby krve pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí.
Zabezpečení armády krví je řešeno systémem distribuce z vojenského transfúzního centra, které přímo zásobuje krví ROLE 3 a 4 a zahraniční mise. ROLE 2 je v případě potřeby zásobena z ROLE 3 přípravky od univerzálních dárců, v ROLE 1 se s podáním krve nepočítá. Odběry dárců krve zajišťují mobilní odběrové týmy, schopné odebrat dárce i v polních podmínkách. Pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí velkého rozsahu, je ale potřeba mít k dispozici kdykoli mobilizovatelnou zásobu erytrocytů univerzální krevní skupiny 0. Tomuto požadavku nejlépe odpovídá strategický sklad kryokonzervovaných erytrocytů.
V ČR dosud problém nebyl řešen v rámci žádného resortu, nebyla dostupná ani alternativní náhrada v rámci zahraniční spolupráce. Zásoby krve pro potřeby AČR jsou tvořeny pouze běžnými transfúzními přípravky s limitovanou dobou použitelnosti, pro případy možné zvýšené potřeby jsou tyto zásoby navyšovány mimořádnými odběry a nákupy zatížené malou pružností a následnou vysokou mírou exspirace. Nová bezpečnostní rizika v podobě globálního terorismu s možností vzniku masivních zdravotnických ztrát mezi obyvatelstvem problém okamžitých zásob krve povyšuje na úroveň celospolečenského zájmu, resp. strategické potřeby státu.
Jednou z možností, jak tyto situace řešit, je uchovávání hlubokomražené krve připravené speciálními postupy - kryokonzervací. Různé postupy kryokonzervace erytrocytů jsou obecně známy a používány již delší dobu, limitujícím faktorem byla dosud zejména doba použitelnosti - zpravidla pouhý jeden den po rozmražení - a tím velmi omezená operativnost použití takového přípravku.
V posledních letech, s nástupem nových technologií a přídavných tzv. resuspenzních roztoků, se doba použitelnosti krve po rozmražení a přípravě k podání (tzv. rekonstituci) prodloužila na 1 - 2 týdny.
Zásadním předmětem výzkumných prací projektu byl výzkum a validace metodiky umožňující výrobu kryokonzervovaných erytrocytů použitelných minimálně 3 týdny po rekonstituci a stanovení postupů výroby a použití takového transfúzního přípravku v léčebně odsunovém systému zdravotnického zabezpečení armády.

2. Souhrn

Zabezpečení armády krví je řešeno systémem distribuce z vojenského transfúzního centra, které přímo zásobuje krví ROLE 3, ROLE 4 a zahraniční mise. ROLE 2 je v případě potřeby zásobena z ROLE 3 přípravky od univerzálních dárců, v ROLE 1 se s podáním krve nepočítá. Odběry dárců krve zajišťují mobilní odběrové týmy, schopné odebrat dárce i v polních podmínkách. Pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí velkého rozsahu, je ale potřeba mít k dispozici kdykoli mobilizovatelnou zásobu erytrocytů univerzální krevní skupiny 0. Tomuto požadavku nejlépe odpovídá strategický sklad kryokonzervovaných erytrocytů.
Projekt řeší vývoj a zavedení metodiky získávání a dlouhodobého skladování erytrocytů pro strategické, speciální a léčebné potřeby Armády České republiky a státu. Jako výchozí zkoumaná metoda bylo zvoleno mražení erytrocytů získaných dvojitou erytrocytaferézou ve vysoké koncentraci glycerolu při -80°C a teplotě skladování -65°C a nižší s technologií glycerolizace a deglycerolizace erytrocytů za použití uzavřeného automatického systému Haemonetics ACP 215. Byl ověřen vliv různých resuspenzních roztoků a následné použití deglycerolizovaných erytrocytů jednak formou otevřené klinické studie u zdravých dobrovolníků a jednak formou in vitro laboratorních testů.
Uzavřeným způsobem rozmražené a rekonstituované erytrocyty v Nutricelu na zařízení Haemonetics ACP-215 byly hodnoceny ve dnech 0, 7, 14 a 21 po rozmrazení 51Cr značenými erytrocyty, resp. den 0 a 7 v SAG-M. Bylo měřeno 24 hodinové přežívání autologních erytrocytů podávaných zdravým dobrovolníkům a stanoven index terapeutické účinnosti (ITE) za pomoci tzv."freeze-thaw-wash-recovery" (FTW%) závislého na množství hemoglobinu v odpadu po promytí rozmražených erytrocytů. Celkem bylo zmraženo, rekonstituováno a takto změřeno 140 TU erytrocytů. Erytrocyty rekonstituované v Nutricelu vykazují 70% ITE ještě v den 21, shodně jako erytrocyty v SAG-M (73%) v den 7. Byla prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Laboratorními testy in vitro byly sledovány změny Hb, Ht, Le, hemolýzy, osmolality, pH, K, P, ATP, NH2 a 2,3 DPG. Výsledky měření těchto laboratorních parametrů prokázaly dobrou použitelnost zmražených erytrocytů ještě 3 týdny po rozmražení, rekonstituci v Nutricelu a skladování při teplotě 2-6°C, resp.1týden po rekonstituci v SAG-M.
Byla vypracována metodika tzv. elektronického křížového pokusu, který při nahrazení klasického sérologického testu kompatibility umožňuje podstatné zrychlení výdeje krve.
Projekt navazuje na koncepční projekt "Krev" - Zabezpečení armády krví a krevními deriváty za bojové pohotovosti státu a v současné době bylo zahájeno postupné plnění strategické krevní banky. Přepokládané naplnění cílové kapacity 3000 T.U. erytrocytů je do roku 2008.
V první etapě, tj. v roce 2003/2004, byly vypracovány standardní operační postupy na jednotlivé výrobní postupy kryokonzervace erytrocytů, byla provedena in vitro fáze měření vybraných laboratorních hodnot erytrocytů po rozmražení a rekonstituci a vypracován protokol klinického hodnocení pro in vivo fázi, tj. sledování přežívání rekonstituovaných erytrocytů značených radioaktivním chromem v oběhu po aplikaci zdravým dobrovolníkům. V této etapě byl také vyvinut software pro skladování a sledování hlubokomražených erytrocytů.
Ve druhé etapě, tj. v roce 2004/2005, bylo provedeno klinické hodnocení, které ověřilo terapeutickou účinnost zmražených erytrocytů odebraných metodou dvojité erytrocytaferézy a okamžitě zmražených ve 40% roztoku glycerolu. Na základě praktických zkušeností z první etapy došlo k malé technologické změně, kdy nebyly pro zmrazení erytrocytů nadále používány primární PVC sběrné vaky, ale krvinky se následně po odběru přepouštěly do speciálních kryokozervačních vaků s polypropylenem.
Nad rámec původního projektu a stanovených cílů byla vypracována a do rutinního provozu zavedena metodika tzv. elektronického křížového pokusu.
Ve třetí etapě, tj. v roce 2005, byla nad rámec původních cílů provedena validace postupů kryokonzervace o erytrocyty kryokonzervované, získané z odběrů plné krve a dále delekoutizované z plné krve i aferézy - a to metodou laboratorního sledování in vitro.
Vyšetřování kryokonzervovaných přípravků na infekce VHB, VHC a HIV metodou detekce nukleové kyseliny (PCR) bylo, na rozdíl od původního předpokladu zajištění PCR vyšetření dodavatelským způsobem, řešeno zřízením laboratoře molekulární biologie v rámci OHBKT ÚVN, protože toto vyšetření pro potřeby transfúzní služby není t.č. v ČR k dispozici.
Ve spolupráci s Národní referenční laboratoří pro imunohematologii na Ústavu hematologie a krevní transfúze v Praze, byl koncem roku 2005 zahájen sběr a mražení autologních erytrocytů u pacientů s výskytem aloprotilátek proti erytrocytům, jejichž specifita znemožňuje použití běžného transfúzního přípravku.
Zavedená technologie již také umožnila dovoz vzácných zmražených erytrocytů se vzácnou antigenní strukturou ze zahraničí a jejich následnou přípravu pro podání pacientům. V ČR je tak poprvé k dispozici metodika a technologie, která zajišťuje dostupnost transfúzní léčby pro pacienty s vysokým rizikem tvorby antierytrocytárních protilátek, případně již s vytvořenými, jejichž specifita znemožňuje použití běžného transfúzního přípravku.
Byl podán návrh na zařazení kryokonzervovaných erytrocytů jako nového léčiva (léčivých přípravků) do kategorizace léčiv na podzim roku 2005 a pak na základě vyzvání Odboru farmacie MZdrav ještě jednou v lednu 2006.

3. Přehled současného stavu ve světě

Zabezpečení strategickými zásobami krve je v zemích NATO na různé úrovni. Budování a výstavba skladů mražených erytrocytů v rámci ozbrojených sil je v každém případě jedním z opakovaných doporučení posledních dvou "NATO Blood Conference". Systémovým a kapacitním vojenským skladem kryokonzervovaných erytrocytů v současné disponují USA a Velká Británie, dále vojenská tranfúzní služba Belgie, ve spolupráci s civilním sektorem je provozován v Nizozemsku, Německu a Francii. Banka zmražené krve je několik let v provozu v univerzitní nemocnici San Martino v Janově, kde erytrocyty zmražené ve 40% glycerolu jsou používány v autotransfúzních programech a dále k překlenutí sezónních a jiných výkyvů v zásobování krví. Z novějších členů NATO podobný systém uchovávání strategických zásob erytrocytů připravuje Slovensko.
Co se týče použitých technologií, tak banka zmražených erytrocytů získávaných výhradně metodou dvojité erytrocytaferézy je provozována zdravotnickou službou armády Belgického království. Erytrocyty jsou mraženy v primárních odběrových vacích ve 40% glycerolu, rekonstituovány na Haemonetics ACP-215 a resuspendovány v Nutricelu s dobou použitelnosti 2 týdny.
Na technologii uzavřeného způsobu rekonstituce a Nutricel v posledních letech přešla i holandská vojenské transfúzní služba, která vybavuje zařízeními Haemonetics ACP-215 i polní nemocnice. Naproti tomu civilní transfúzní služba v Holandsku erytrocyty mrazí v prostředí tekutého dusíku s použitím 20% glycerolu a rozmrazuje otevřeným způsobem.
Ozbrojené síly USA a jejich ASBP (Armed Services Blood Program) je v posledních letech ve stádiu probíhající změny technologie rekonstituce erytrocytů z otevřeného způsobu na systém uzavřený. Strategické zásoby se zmrazí za použití 40% glycerolu, lokálně je ale stále ještě používána i technologie mrazení v tekutém dusíku s 20% glycerolem. Jako resuspenzní roztok je používán především SAG-M, protože použití Nutricelu je limitováno doporučením FDA.
Ačkoli některé publikace uvádí možnou hranici použití rekonstituovaných erytrocytů v Nutricelu až 40 dní, nikde na světě zatím neproběhla dostatečně reprezentativní validační studie, na základě které by byly potvrzeny technologické postupy přípravy umožňující delší dobu použitelnosti rekonstituovaných erytrocytů než 14 dní. V tomto ohledu jsou předkládané výsledky projektu obranného výzkumu "Erytrocyt" průlomové.

4. Metodika řešení

Byla stanovena pracovní hypotéza, která vycházela z předpokladu, že při použití technologie získávání erytrocytů metodou dvojité erytrocytaferézy a zmražení bezprostředně po odběru ve 40% glycerolu a po rozmražení a rekonstituci v roztoku AS-3 (Nutricelu) mohou svými vlastnostmi splňovat podmínky pro dobu použitelnosti delší než dle stávajících světových zkušeností max. 2 týdny. Jako kontrolní rekonstituční roztok byl použit SAG-Manitol, s očekávanou dobou použitelnosti erytrocytů po rekonstituci max. 1 týden. Ověření proběhlo na základě laboratorních in vitro sledování a in vivo fáze provedením otevřené klinické studie na zdravých dobrovolnících.

In vitro fáze:
Rozmražené erytrocyty rekonstituované na přístroji Haemonetics ACP-215 byly laboratorně vyšetřovány v den 0, 5, 10, 14, 18 a 21 po rekonstituci. Sledována byla ztráta Hb, Ht, Le, hemolýza, osmolalita, pH, K, P, ATP, NH2 a 2,3 DPG. Vyšetřeno bylo 60 TU erytrocytů, z toho 30 rekonstituovaných v Nutricelu, 30 v SAG-M. Dále byly vyšetřeny rekonstituované erytrocyty při in vivo klinické fázi studie, tj. v den 0, 7, 14, 21 v Nutricelu a den 0, 7 v SAG-M (celkem 140 TU). Pro ověření parametrů zmražených a rekonstituovaných erytrocytů získaných dalšími způsoby odběru, bylo následně vyšetřeno ještě dalších 30 TU erytrocytů, získaných dvojitou erytrocytaferézou a deleukotizovaných, dále získaných z odběrů plné krve jednak jako erytrocyty bez buffy-coatu a jednak jako deleukotizované.

Klinická studie (in vivo fáze) - ověření terapeutické účinnosti kryokonzervovaných erytrocytů:
Uzavřeným způsobem rozmražené a rekonstituované erytrocyty v Nutricelu na zařízení Haemonetics ACP-215 byly hodnoceny ve dnech 0, 7, 14 a 21 po rozmrazení 51Cr značenými erytrocyty, resp. den 0 a 7 v SAG-M. Bylo měřeno 24 hodinové přežívání autologních erytrocytů podávaných zdravým dobrovolníkům a stanoven index terapeutické účinnosti (ITE) za pomoci "freeze-thaw-wash-recovery" (FTW%) závislého na množství volného hemoglobinu v odpadu po promytí. Celkem bylo zmraženo, rekonstituováno a změřeno 140 TU erytrocytů získaných metodou dvojité erytrocytaferézy.

Zásadní závěry klinické studie se týkají terapeutické účinnosti erytrocytů. Erytrocyty rekonstituované v Nutricelu vykazují 70% ITE ještě v den 21, shodně jako erytrocyty v SAG-M (73%) v den 7. Byla prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Tyto závěry jsou podpořeny výsledky in vitro laboratorních testů, které také potvrzují dobrou dobu použitelnosti ještě 3 týdny po rozmražení erytrocytů resuspendovaných v Nutricelu, resp. 1 týden erytrocytů resuspendovaných v SAG-M, a prvních 60 TU zmražených erytrocytů bylo výchozí podmínkou pro pokračování testování v in vivo klinické fázi. Měřením následných 140 TU zmražených erytrocytů použitých v rámci klinické studie byla mj. prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Výsledky klinické studie jsou podrobně popsány v příloze č. 2 - Závěrečné zprávě klinického hodnocení "Otevřené klinické hodnocení účinnosti erytrocytů z aferézy kryokonzervovaných v Nutricelu nebo SAG-M u zdravých dobrovolníků".
Naměřené hodnoty in vitro fáze měření laboratorních parametrů kryokonzervovaných erytrocytů po rekonstituci jsou obsaženy jednak v příslušné kapitole Závěrečné zprávy klinického hodnocení (příl. č.2) a dále v příloze č. 3 "In vitro parametry rekonstituovaných erytrocytů". Tato příloha shrnuje výsledky validační studie kryokonzervace erytrocytů připravených z plné krve bez buffy coatu a deleukotizovaných a také erytrocytů deleukotizovaných - získaných dvojitou erytrocytaferézou, provedené nad rámec původního zadání v roce 2005. Všechny výsledky laboratorních testů in vitro potvrzují dobrou použitelnost erytrocytů rekonstituovaných v Nutricelu po dobu 3 týdnů, kdy poněkud lepší parametry vykazují erytrocyty deleukotizované.

Úvod:

Před každým podáním krve, před každou provedenou transfúzí, je povinností provést tzv. křížový pokus, kdy se laboratorně ověří shoda (kompatibilita) transfúzního přípravku (krve dárce) s krví příjemce (pacienta). Jedná se o kvalifikovaný rutinní laboratorní výkon, jehož účelem je vyloučit nebo významně omezit možnost záměny nebo nežádoucí potransfúzní reakce.
Současné moderní automatizované a počítačové technologie ale umožňují i tento dosud výlučný laboratorní proces provádět automatizovaně, bez nutnosti vlastního laboratorního ověřování. Výhodou je vyloučení lidské chyby a významná úspora reagencií a také času.
Do nedávné doby byly tyto vysoce sofistikované technologie doménou pouze několika vybraných laboratoří v USA, zde ale došlo v posledních letech k jejich poměrně mohutnému rozšíření, zavádí je i řada pracovišť evropských, velmi užívanou metodou je v Japonsku a Jižní Koreji.
Nákupem plně automatických imunohematologických analyzátorů Galileo Immucor, se v roce 2003 otevřela i laboratoři krevního skladu OHBKT ÚVN cesta k zavedení této progresivní metodiky. Vývoj a validace této metodiky tak, aby odpovídala plně požadavkům pro použití na OHBKT ÚVN, probíhal v letech 2004 - 2005 a 1. 8. 2005 byla uvedena do rutinního provozu. Jedná se o první aplikaci tohoto druhu nejen v ČR, ale i ve střední a východní Evropě.

Souhrnný popis

Elektronický křížový pokus (zkouška kompatibility, dále jen EKP), je metoda zjišťování kompatibility (slučitelnosti) transfúzního přípravku s krví příjemce prostřednictvím korektně zjištěných dat o dárci a příjemci po jejich bezpečném zadáním do informačního systému. Ten pak na základě předem daných a neměnných kritérií automatizovaným způsobem určí, zda je možné daný erytrocytární transfúzní přípravek potřebnému příjemci podat, či zda je nutno provést sérologickou zkoušku kompatibility. EKP v případě OHBKT ÚVN je softwarovou nadstavbou standardní laboratoře předtransfúzních vyšetření informačního systému AMIS*TRA. Zajišťuje elektronickou kontrolu splnění podmínek pro podání krví bez předchozího provedení klasického laboratorního testu kompatibility.
Podmínkou zavedení metody do rutinního provozu byla její validace, která proběhla na testovacích datech, obsahujících všechny možné alternativy, připadající v úvahu v reálném provozu, které je nutno validovat. Důraz byl kladen zejména na ověření bezpečnosti metody a korektnosti vydávaných výsledků. Jednalo se o 1 ověření obecných předpokladů (tj. ověření přenosu dat), 2/ provedení speciálně designovaných programových testů, simulujících konfliktní situace, 3/ ověření shody EKP se sérologickým křížovým pokusem.

Závěr:

Metoda EKP významně urychluje a zlevňuje proces křížení a vydávání krví v případech předem známých a ověřených a z imunohematologického hlediska nekonfliktních pacientů. V provozu ÚVN, ve kterém jsme EKP rutinně zavedli od 1. 8. 2005, představuje t.č. cca 85% všech testů kompatibility. Provedení standardního serologického KP při tom nijak nekomplikuje ani nezdržuje. Metodika spolu s předcházejícím zavedení automatizované systému Galileo Immucor navíc umožnila snížení počtu pracovníků na úsecích transfúzních laboratoří OHBKT ÚVN o 2 laborantky, tj. o 22%.