Výzkumný projekt - Kryokonzervace erytrocytů - vybudování banky zmražené krve: "Strategická krevní banka"
1. Úvod
Zásobování krví a transfúzními přípravky a náhrada krve je stálým strategickým a logistickým problémem zdravotnické služby armád celého světa, který vyplývá z podstaty krve jako léčiva, tj. biologického přípravku, který má omezenou dobu použitelnosti, specifické a omezující podmínky přepravy, skladování a aplikace pacientům. Ze shodného důvodu je problematická tzv. krizová krevní politika státu, kdy při zachování obvyklých a běžně používaných postupů je obtížné zajistit dostatečné zásoby krve pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí.
Zabezpečení armády krví je řešeno systémem distribuce z vojenského transfúzního centra, které přímo zásobuje krví ROLE 3 a 4 a zahraniční mise. ROLE 2 je v případě potřeby zásobena z ROLE 3 přípravky od univerzálních dárců, v ROLE 1 se s podáním krve nepočítá. Odběry dárců krve zajišťují mobilní odběrové týmy, schopné odebrat dárce i v polních podmínkách. Pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí velkého rozsahu, je ale potřeba mít k dispozici kdykoli mobilizovatelnou zásobu erytrocytů univerzální krevní skupiny 0. Tomuto požadavku nejlépe odpovídá strategický sklad kryokonzervovaných erytrocytů.
V ČR dosud problém nebyl řešen v rámci žádného resortu, nebyla dostupná ani alternativní náhrada v rámci zahraniční spolupráce. Zásoby krve pro potřeby AČR jsou tvořeny pouze běžnými transfúzními přípravky s limitovanou dobou použitelnosti, pro případy možné zvýšené potřeby jsou tyto zásoby navyšovány mimořádnými odběry a nákupy zatížené malou pružností a následnou vysokou mírou exspirace. Nová bezpečnostní rizika v podobě globálního terorismu s možností vzniku masivních zdravotnických ztrát mezi obyvatelstvem problém okamžitých zásob krve povyšuje na úroveň celospolečenského zájmu, resp. strategické potřeby státu.
Jednou z možností, jak tyto situace řešit, je uchovávání hlubokomražené krve připravené speciálními postupy - kryokonzervací. Různé postupy kryokonzervace erytrocytů jsou obecně známy a používány již delší dobu, limitujícím faktorem byla dosud zejména doba použitelnosti - zpravidla pouhý jeden den po rozmražení - a tím velmi omezená operativnost použití takového přípravku.
V posledních letech, s nástupem nových technologií a přídavných tzv. resuspenzních roztoků, se doba použitelnosti krve po rozmražení a přípravě k podání (tzv. rekonstituci) prodloužila na 1 - 2 týdny.
Zásadním předmětem výzkumných prací projektu byl výzkum a validace metodiky umožňující výrobu kryokonzervovaných erytrocytů použitelných minimálně 3 týdny po rekonstituci a stanovení postupů výroby a použití takového transfúzního přípravku v léčebně odsunovém systému zdravotnického zabezpečení armády.
2. Souhrn
Zabezpečení armády krví je řešeno systémem distribuce z vojenského transfúzního centra, které přímo zásobuje krví ROLE 3, ROLE 4 a zahraniční mise. ROLE 2 je v případě potřeby zásobena z ROLE 3 přípravky od univerzálních dárců, v ROLE 1 se s podáním krve nepočítá. Odběry dárců krve zajišťují mobilní odběrové týmy, schopné odebrat dárce i v polních podmínkách. Pro případ náhlého napadení, teroristického útoku nebo hromadného neštěstí velkého rozsahu, je ale potřeba mít k dispozici kdykoli mobilizovatelnou zásobu erytrocytů univerzální krevní skupiny 0. Tomuto požadavku nejlépe odpovídá strategický sklad kryokonzervovaných erytrocytů.
Projekt řeší vývoj a zavedení metodiky získávání a dlouhodobého skladování erytrocytů pro strategické, speciální a léčebné potřeby Armády České republiky a státu. Jako výchozí zkoumaná metoda bylo zvoleno mražení erytrocytů získaných dvojitou erytrocytaferézou ve vysoké koncentraci glycerolu při -80°C a teplotě skladování -65°C a nižší s technologií glycerolizace a deglycerolizace erytrocytů za použití uzavřeného automatického systému Haemonetics ACP 215. Byl ověřen vliv různých resuspenzních roztoků a následné použití deglycerolizovaných erytrocytů jednak formou otevřené klinické studie u zdravých dobrovolníků a jednak formou in vitro laboratorních testů.
Uzavřeným způsobem rozmražené a rekonstituované erytrocyty v Nutricelu na zařízení Haemonetics ACP-215 byly hodnoceny ve dnech 0, 7, 14 a 21 po rozmrazení 51Cr značenými erytrocyty, resp. den 0 a 7 v SAG-M. Bylo měřeno 24 hodinové přežívání autologních erytrocytů podávaných zdravým dobrovolníkům a stanoven index terapeutické účinnosti (ITE) za pomoci tzv."freeze-thaw-wash-recovery" (FTW%) závislého na množství hemoglobinu v odpadu po promytí rozmražených erytrocytů. Celkem bylo zmraženo, rekonstituováno a takto změřeno 140 TU erytrocytů. Erytrocyty rekonstituované v Nutricelu vykazují 70% ITE ještě v den 21, shodně jako erytrocyty v SAG-M (73%) v den 7. Byla prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Laboratorními testy in vitro byly sledovány změny Hb, Ht, Le, hemolýzy, osmolality, pH, K, P, ATP, NH2 a 2,3 DPG. Výsledky měření těchto laboratorních parametrů prokázaly dobrou použitelnost zmražených erytrocytů ještě 3 týdny po rozmražení, rekonstituci v Nutricelu a skladování při teplotě 2-6°C, resp.1týden po rekonstituci v SAG-M.
Byla vypracována metodika tzv. elektronického křížového pokusu, který při nahrazení klasického sérologického testu kompatibility umožňuje podstatné zrychlení výdeje krve.
Projekt navazuje na koncepční projekt "Krev" - Zabezpečení armády krví a krevními deriváty za bojové pohotovosti státu a v současné době bylo zahájeno postupné plnění strategické krevní banky. Přepokládané naplnění cílové kapacity 3000 T.U. erytrocytů je do roku 2008.
V první etapě, tj. v roce 2003/2004, byly vypracovány standardní operační postupy na jednotlivé výrobní postupy kryokonzervace erytrocytů, byla provedena in vitro fáze měření vybraných laboratorních hodnot erytrocytů po rozmražení a rekonstituci a vypracován protokol klinického hodnocení pro in vivo fázi, tj. sledování přežívání rekonstituovaných erytrocytů značených radioaktivním chromem v oběhu po aplikaci zdravým dobrovolníkům. V této etapě byl také vyvinut software pro skladování a sledování hlubokomražených erytrocytů.
Ve druhé etapě, tj. v roce 2004/2005, bylo provedeno klinické hodnocení, které ověřilo terapeutickou účinnost zmražených erytrocytů odebraných metodou dvojité erytrocytaferézy a okamžitě zmražených ve 40% roztoku glycerolu. Na základě praktických zkušeností z první etapy došlo k malé technologické změně, kdy nebyly pro zmrazení erytrocytů nadále používány primární PVC sběrné vaky, ale krvinky se následně po odběru přepouštěly do speciálních kryokozervačních vaků s polypropylenem.
Nad rámec původního projektu a stanovených cílů byla vypracována a do rutinního provozu zavedena metodika tzv. elektronického křížového pokusu.
Ve třetí etapě, tj. v roce 2005, byla nad rámec původních cílů provedena validace postupů kryokonzervace o erytrocyty kryokonzervované, získané z odběrů plné krve a dále delekoutizované z plné krve i aferézy - a to metodou laboratorního sledování in vitro.
Vyšetřování kryokonzervovaných přípravků na infekce VHB, VHC a HIV metodou detekce nukleové kyseliny (PCR) bylo, na rozdíl od původního předpokladu zajištění PCR vyšetření dodavatelským způsobem, řešeno zřízením laboratoře molekulární biologie v rámci OHBKT ÚVN, protože toto vyšetření pro potřeby transfúzní služby není t.č. v ČR k dispozici.
Ve spolupráci s Národní referenční laboratoří pro imunohematologii na Ústavu hematologie a krevní transfúze v Praze, byl koncem roku 2005 zahájen sběr a mražení autologních erytrocytů u pacientů s výskytem aloprotilátek proti erytrocytům, jejichž specifita znemožňuje použití běžného transfúzního přípravku.
Zavedená technologie již také umožnila dovoz vzácných zmražených erytrocytů se vzácnou antigenní strukturou ze zahraničí a jejich následnou přípravu pro podání pacientům. V ČR je tak poprvé k dispozici metodika a technologie, která zajišťuje dostupnost transfúzní léčby pro pacienty s vysokým rizikem tvorby antierytrocytárních protilátek, případně již s vytvořenými, jejichž specifita znemožňuje použití běžného transfúzního přípravku.
Byl podán návrh na zařazení kryokonzervovaných erytrocytů jako nového léčiva (léčivých přípravků) do kategorizace léčiv na podzim roku 2005 a pak na základě vyzvání Odboru farmacie MZdrav ještě jednou v lednu 2006.
3. Přehled současného stavu ve světě
Zabezpečení strategickými zásobami krve je v zemích NATO na různé úrovni. Budování a výstavba skladů mražených erytrocytů v rámci ozbrojených sil je v každém případě jedním z opakovaných doporučení posledních dvou "NATO Blood Conference". Systémovým a kapacitním vojenským skladem kryokonzervovaných erytrocytů v současné disponují USA a Velká Británie, dále vojenská tranfúzní služba Belgie, ve spolupráci s civilním sektorem je provozován v Nizozemsku, Německu a Francii. Banka zmražené krve je několik let v provozu v univerzitní nemocnici San Martino v Janově, kde erytrocyty zmražené ve 40% glycerolu jsou používány v autotransfúzních programech a dále k překlenutí sezónních a jiných výkyvů v zásobování krví. Z novějších členů NATO podobný systém uchovávání strategických zásob erytrocytů připravuje Slovensko.
Co se týče použitých technologií, tak banka zmražených erytrocytů získávaných výhradně metodou dvojité erytrocytaferézy je provozována zdravotnickou službou armády Belgického království. Erytrocyty jsou mraženy v primárních odběrových vacích ve 40% glycerolu, rekonstituovány na Haemonetics ACP-215 a resuspendovány v Nutricelu s dobou použitelnosti 2 týdny.
Na technologii uzavřeného způsobu rekonstituce a Nutricel v posledních letech přešla i holandská vojenské transfúzní služba, která vybavuje zařízeními Haemonetics ACP-215 i polní nemocnice. Naproti tomu civilní transfúzní služba v Holandsku erytrocyty mrazí v prostředí tekutého dusíku s použitím 20% glycerolu a rozmrazuje otevřeným způsobem.
Ozbrojené síly USA a jejich ASBP (Armed Services Blood Program) je v posledních letech ve stádiu probíhající změny technologie rekonstituce erytrocytů z otevřeného způsobu na systém uzavřený. Strategické zásoby se zmrazí za použití 40% glycerolu, lokálně je ale stále ještě používána i technologie mrazení v tekutém dusíku s 20% glycerolem. Jako resuspenzní roztok je používán především SAG-M, protože použití Nutricelu je limitováno doporučením FDA.
Ačkoli některé publikace uvádí možnou hranici použití rekonstituovaných erytrocytů v Nutricelu až 40 dní, nikde na světě zatím neproběhla dostatečně reprezentativní validační studie, na základě které by byly potvrzeny technologické postupy přípravy umožňující delší dobu použitelnosti rekonstituovaných erytrocytů než 14 dní. V tomto ohledu jsou předkládané výsledky projektu obranného výzkumu "Erytrocyt" průlomové.
4. Metodika řešení
Byla stanovena pracovní hypotéza, která vycházela z předpokladu, že při použití technologie získávání erytrocytů metodou dvojité erytrocytaferézy a zmražení bezprostředně po odběru ve 40% glycerolu a po rozmražení a rekonstituci v roztoku AS-3 (Nutricelu) mohou svými vlastnostmi splňovat podmínky pro dobu použitelnosti delší než dle stávajících světových zkušeností max. 2 týdny. Jako kontrolní rekonstituční roztok byl použit SAG-Manitol, s očekávanou dobou použitelnosti erytrocytů po rekonstituci max. 1 týden. Ověření proběhlo na základě laboratorních in vitro sledování a in vivo fáze provedením otevřené klinické studie na zdravých dobrovolnících.
In vitro fáze:
Rozmražené erytrocyty rekonstituované na přístroji Haemonetics ACP-215 byly laboratorně vyšetřovány v den 0, 5, 10, 14, 18 a 21 po rekonstituci. Sledována byla ztráta Hb, Ht, Le, hemolýza, osmolalita, pH, K, P, ATP, NH2 a 2,3 DPG. Vyšetřeno bylo 60 TU erytrocytů, z toho 30 rekonstituovaných v Nutricelu, 30 v SAG-M. Dále byly vyšetřeny rekonstituované erytrocyty při in vivo klinické fázi studie, tj. v den 0, 7, 14, 21 v Nutricelu a den 0, 7 v SAG-M (celkem 140 TU). Pro ověření parametrů zmražených a rekonstituovaných erytrocytů získaných dalšími způsoby odběru, bylo následně vyšetřeno ještě dalších 30 TU erytrocytů, získaných dvojitou erytrocytaferézou a deleukotizovaných, dále získaných z odběrů plné krve jednak jako erytrocyty bez buffy-coatu a jednak jako deleukotizované.
Klinická studie (in vivo fáze) - ověření terapeutické účinnosti kryokonzervovaných erytrocytů:
Uzavřeným způsobem rozmražené a rekonstituované erytrocyty v Nutricelu na zařízení Haemonetics ACP-215 byly hodnoceny ve dnech 0, 7, 14 a 21 po rozmrazení 51Cr značenými erytrocyty, resp. den 0 a 7 v SAG-M. Bylo měřeno 24 hodinové přežívání autologních erytrocytů podávaných zdravým dobrovolníkům a stanoven index terapeutické účinnosti (ITE) za pomoci "freeze-thaw-wash-recovery" (FTW%) závislého na množství volného hemoglobinu v odpadu po promytí. Celkem bylo zmraženo, rekonstituováno a změřeno 140 TU erytrocytů získaných metodou dvojité erytrocytaferézy.
Zásadní závěry klinické studie se týkají terapeutické účinnosti erytrocytů. Erytrocyty rekonstituované v Nutricelu vykazují 70% ITE ještě v den 21, shodně jako erytrocyty v SAG-M (73%) v den 7. Byla prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Tyto závěry jsou podpořeny výsledky in vitro laboratorních testů, které také potvrzují dobrou dobu použitelnosti ještě 3 týdny po rozmražení erytrocytů resuspendovaných v Nutricelu, resp. 1 týden erytrocytů resuspendovaných v SAG-M, a prvních 60 TU zmražených erytrocytů bylo výchozí podmínkou pro pokračování testování v in vivo klinické fázi. Měřením následných 140 TU zmražených erytrocytů použitých v rámci klinické studie byla mj. prokázána téměř lineární závislost ITE, FTW% na hemoglobinu v odpadu.
Výsledky klinické studie jsou podrobně popsány v příloze č. 2 - Závěrečné zprávě klinického hodnocení "Otevřené klinické hodnocení účinnosti erytrocytů z aferézy kryokonzervovaných v Nutricelu nebo SAG-M u zdravých dobrovolníků".
Naměřené hodnoty in vitro fáze měření laboratorních parametrů kryokonzervovaných erytrocytů po rekonstituci jsou obsaženy jednak v příslušné kapitole Závěrečné zprávy klinického hodnocení (příl. č.2) a dále v příloze č. 3 "In vitro parametry rekonstituovaných erytrocytů". Tato příloha shrnuje výsledky validační studie kryokonzervace erytrocytů připravených z plné krve bez buffy coatu a deleukotizovaných a také erytrocytů deleukotizovaných - získaných dvojitou erytrocytaferézou, provedené nad rámec původního zadání v roce 2005. Všechny výsledky laboratorních testů in vitro potvrzují dobrou použitelnost erytrocytů rekonstituovaných v Nutricelu po dobu 3 týdnů, kdy poněkud lepší parametry vykazují erytrocyty deleukotizované.
